实验六：肝脏谷丙转氨酶活力测定[日期：2005-4-18] 来源： 作者：lt [字体：大 中 小] 一目的 了解转氨酶的性质及临床意义掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二原理 在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基地大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。本实验以丙氨酸和a-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。a-酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处a-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和a-酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。三 实验材料、器材鸡肝脏研钵试管试管架玻璃搅拌棒滴管容量瓶电子天平分光光度计吸管四 实验试剂标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05M H2SO4中，现用现配。谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1M 的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。0.1M pH7.4 PBS：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1M HCl中。加热溶解，用1M HCl定容到100ml。0.4M NaOH ：称取16g NaOH定容到1000ml。0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。五、操作1.样品的制备（集体制备）将鸡处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。2.样品测定加样顺序 测定管 标准管 对照管 空白管 谷丙转氨酶底物（ml） 0.5 0.5 / / 37℃水浴保温5min 肝匀浆 （ml） 0.1 标准丙酮酸 0.1 0.1 0.1 混匀后，37℃水浴保温30min 2，4二硝基苯肼（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物（ml） / / 0.5 0.5 混匀后，37℃水浴保温20min 0.4mol/L NaOH （ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，读取测定管与对照管的吸光度，将测定管的吸光度减去样品管的吸光度后与标准管进行比较算出相当于丙酮酸的含量。3.谷丙转氨酶活力计算：本法规定酶在37℃与底物30min后能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位。六计算 每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位：D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/SD:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)式中 A:样品管吸光度值B:对照管吸光度值S:标准管吸光度值500:标准丙酮酸溶液2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数 参考资料：http://youth.sdut.edu.cn/smkx/show.aspx?id=175&cid=60

具体的实验步骤是什么？

实验六：肝脏谷丙转氨酶活力测定[日期：2005-4-18] 来源： 作者：lt [字体：大 中 小] 一目的 了解转氨酶的性质及临床意义掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二原理 在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基地大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。本实验以丙氨酸和a-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。a-酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处a-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和a-酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。三 实验材料、器材鸡肝脏研钵试管试管架玻璃搅拌棒滴管容量瓶电子天平分光光度计吸管四 实验试剂标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05M H2SO4中，现用现配。谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1M 的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。0.1M pH7.4 PBS：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1M HCl中。加热溶解，用1M HCl定容到100ml。0.4M NaOH ：称取16g NaOH定容到1000ml。0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。五、操作1.样品的制备（集体制备）将鸡处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。2.样品测定加样顺序 测定管 标准管 对照管 空白管 谷丙转氨酶底物（ml） 0.5 0.5 / / 37℃水浴保温5min 肝匀浆 （ml） 0.1 标准丙酮酸 0.1 0.1 0.1 混匀后，37℃水浴保温30min 2，4二硝基苯肼（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物（ml） / / 0.5 0.5 混匀后，37℃水浴保温20min 0.4mol/L NaOH （ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，读取测定管与对照管的吸光度，将测定管的吸光度减去样品管的吸光度后与标准管进行比较算出相当于丙酮酸的含量。3.谷丙转氨酶活力计算：本法规定酶在37℃与底物30min后能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位。六计算 每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位：D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/SD:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)式中 A:样品管吸光度值B:对照管吸光度值S:标准管吸光度值500:标准丙酮酸溶液2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数 参考资料：http://youth.sdut.edu.cn/smkx/show.aspx?id=175&cid=60