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华中科技大学硕士学位论文麦芽治疗高泌乳素血症及石楠藤质量标准的研究姓名：魏安华申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：阮金兰 20090501 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文摘要高泌乳素血症HPRL是多种原因导致体内泌乳素（ PRL）水平升高而引起的一组症候群，临床表现为溢乳，闭经，月经稀少，渐胖，不孕，无排卵等1，现临床主要应用麦角碱衍生物，如溴隐亭来进行治疗。但该类药物副作用较多且价格昂贵，因此患者依从性差。麦芽为中医临床上常用的一味中药，具有行气消食、健脾开胃、退乳消胀的作用，临床上常用中药麦芽复方来治疗高泌乳素血症，且单味麦芽煎煮液治疗此病的前期临床观察也取得了满意的疗效，故本实验将进一步研究麦芽对高泌乳素血症的治疗作用，以期确定麦芽治疗该疾病的活性部位或活性成分，将麦芽开发成一种价格低廉、疗效确切的新中药制剂，代替溴隐亭，改变目前主要依赖昂贵进口药物溴隐亭治疗高泌乳素血症的局面。（1）麦芽总提取物对高泌乳素血症雌性小鼠泌乳素水平的影响：设计采用多巴胺受体拮抗剂类药物（灭吐灵）诱导雌性小鼠 HPRL 模型2，利用溴隐亭为对照组，以麦芽总提取物高、中、低剂量灌胃治疗，用放射免疫法检测造模前后及末次给药后小鼠血清中泌乳素水平，经统计软件分析其结果。结果显示麦芽总提取物高、中、低剂量组均能明显降低雌性小鼠血清泌乳素水平（Plt0.05），抑制灭吐灵诱导的高泌乳素血症，作用与溴隐亭相当。而且本实验采用苯酚-硫酸法测定了提取物中糖的含量；采用紫外分光光度法测定了提取物中黄酮的含量。（2）采用麦芽碱性提取物对高泌乳素血症雌性小鼠泌乳素水平的影响：（1）中方法给予麦芽碱性提取物高、中、低剂量治疗，结果说明麦芽碱性提取物高、中、低剂量组均能明显降低雌性小鼠血清泌乳素水平（Plt0.05），提示麦芽中治疗高泌乳素血症的活性部位可能是麦芽中的碱性部位。石楠藤为胡椒科胡椒属植物石楠藤Piper wallichii干燥带叶藤茎或全株。性微温，味辛苦，有祛风湿，通经络，强腰膝，止痛之功效。具有祛风通络，补肾壮阳，止咳平喘，活血止痛功效3。本实验对不同批次石楠藤药材的性状，显微特征进行了描述，对石楠藤的浸出物、总灰分、酸不溶灰分和水分进行了测定，同时对其活性成分荜拨明宁碱（piperlonguminine）进行了薄层定性鉴别 I 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文和 HPLC 定量研究。结果制定了石楠藤的质量控制标准，为药用植物资源的开发利用提供科学依据，为新药开发奠定了基础。其中，首次从胡椒科植物中发现的三种马兜铃内酰胺类成分 4 ，包括Cepharanone B，Aristolactam AⅡ和 Aristololatams AⅢa，均有一定的肾毒性，因此，测定不同批次药材中三种成分的含量是非常必要的。本实验利用HPLC-UV 方法同时测定了不同批次石楠藤药材中三种马兜铃内酰胺的含量，基本完善了石楠藤药材的质量标准，为该药材及传统中药的质量控制和毒性研究奠定了物质基础。关键字：麦芽，高泌乳素血症，石楠藤，质量标准，马兜铃内酰胺，HPLC-UV II 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文 Abstract Hyperprolactinemia HPRL are a group of syndrome caused by many reasonsresulted in reducing of prolactin PRL levels. The clinical performance containedgalactorrhea amenorrhea menstrual scarce fat infertility anovulation1. Now themain treatment drugs are ergot alkaloids such as bromocriptine. However such drugshave many side effects and are more expensive so patients have the poor compliance.Malt is a kind of Chinese medicine commonly use in clinical have the effects such asdigestion appetizer swelling and so on. The compound Chinese medicines arecommonly used in treating HPRL and the pre-clinical observation of single malt hasshow a satisfactory effect in treating this disease. So we make further studies on thetreatment of malt in HPRL to confirm the active site and active constituent in treatingthis disease. And then develop the traditional Chinese drugs into a new Chinese drugspharmaceutics that have exact effect and low-price change the situation of depend onbromocriptine that is the major expensive importing drug to treat HPRL. The effect of total malt extract on PRL level in the female HPRL mice：Induc ingthe female HPRL mice model by metoclopramide that is dopamine receptorantagonist drugs 2 using bromocriptine as the control giving the high medium andlow-dose malt extract treatment detecting the blood serum PRL of byradioimmunoassay analyzing its results with statistical software. The results showedthe blood serum PRL of the high medium and low-dose total malt extract group weresignificantly decreased the difference was significant Plt0.05 the total malt extractcould inhibit HPRL induced by metoclopramide the effect is similar to the role ofbromocriptine. And determining the polysaccharide content of malt extract by thephenol-sulfuric acid method determining the flavonoids content of malt extract byUV spectrophotometer. The effect of basic constituent malt extract on PRL levels in the female HPRL III 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文mice：The method is same as the part of 1. The results showed the blood serum PRLof the high medium and low-dose basic constituents malt extract group weresignificantly decreased the difference was significant Plt0.05. it is evidenced thatthe active constituent of inhibiting HPRL may be the basic constituent malt extract. Piper wallichii was a perennial herb of the genus piper which belong to thefamily piperaceae. This plant was used for promoting blood circulation alleviatingpain improving sexual function and the treatment of beriberoid disease3. In thisstudy the phamacognostic methods were applied the ext ract of Piper wallichii wasexamined moisture and ash were detemined and the bioactive constituents ofpiperlonguminine were analyzed by TLC and HPLC. The established method can beused for the quality control of Piper wallichii. To provide scientific basis for theutilization and development of this herb and lay the foundation in developing newdrugs. In our study aristololactams including Cepharanone B Aristolactam A Ⅱ andAristololatams A Ⅲ a are seperated for the first time from piperaceae and have therenal toxicity4. So it is essential to determine the content of these constituents. Atequal condition the contents of three aristololactams were simultaneously determinedin Piper wallichii by HPLC-UV which could fully help to improve the quality controlof this herb and would provide an important reference to establish the quality controlmethod for other related traditional Chinese medicines preparations. Furthermore theestablished method laid the substance foundation for toxicity studies. KEY WORDS: Malt Hyperprolactinemia Piper wallichii Aristololactam Qualityspecification HPLC-UV IV 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文独创性声明　本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。　　学位论文作者签名：　日期：　　　　年　　　　月　　　　日　　学位论文版权使用授权书　本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。　保密□　，在＿＿＿＿＿年解密后适用本授权书。　本论文属于　不保密□。　（请在以上方框内打“√”　）　　学位论文作者签名：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　指导教师签名：　　日期：　　　　年　　　　月　　　　日　　　　　　　　　　　　　　日期：　　　　年　　　　月　　　　日　　　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文前言高泌乳素血症hyperprolactinemia ， HPRL是指血中泌乳素prolactin，PRL水平高于正常值：包括显性高泌乳素血症24 小时血中 PRL 持续升高和潜在性高泌乳素血症夜间睡眠时 PRL 值超过生理范围或月经周期的某一时间一过性升高，常导致闭经、溢乳、生殖功能下降或不孕等一系列临床综合征5。西医认为高泌乳素血症是因多种病因所致的下丘脑-垂体-性腺轴病变6，病因可分为生理性（睡眠、产后、哺乳、乳头刺激、性交、妊娠等），病理性（丘脑肿瘤、垂体或异位催乳素瘤、肢端肥大症、原发性甲状腺功能减退症、肝肾功能不全等），药物性（干扰多巴胺合成药物或多巴胺受体阻断剂如吩噻嗪类、胃复安、三环抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、利血平、甲基多巴、血管紧张素转换酶抑制剂、异搏定、阿片类、雌激素、西咪替丁等）及特发性，是由于下丘脑产生的 PRL 的生理性抑制物质多巴胺DA与刺激物质促甲状腺素释放激素TRH、5- 羟色胺5-HT、小肠血管活性多肽物VIP等失去平衡所致。高泌乳素血症在普通人群发病率为 0.45，而在生殖障碍女性的发病率高达 9177，多发生于妇女，偶见于儿童和青少年，是危害女性生殖健康的一种常见疾病。目前国内外常见的治疗手段有药物治疗和手术治疗，但手术治疗后也需要药物维持治疗，因此寻找治疗药物显得尤为重要。目前西药主要使用半合成的麦角碱衍生物类制剂溴隐亭、卡麦角胺等，该类药物疗效确切，但不良反应发生率很高，患者依从性很差，加上溴隐亭价格昂贵，长期服药费用很高，以至患者很难坚持治疗。在中医处方中许多复方常用于治疗高泌乳素血症，且近年来不少文献报道采用中药麦芽复方治疗高泌乳素血症取得了满意的疗效。麦芽为禾本科一年生草本植物大麦Hoderumu vglare L.的成熟果实经发芽干燥而得。将麦粒用水浸泡后，保持适宜温、湿度，待幼芽长至约0.5 cm时，干燥即得。全国各地均有种植，以西部和北部地区较多。其味甘，性平，归脾、胃经，具有行气消食、健脾开胃、退乳消胀的作用，用于食积不消，脘腹胀痛，脾虚食少，乳汁郁积，乳房肿痛，妇女断乳。其中生麦芽健脾和胃通乳，用于脾虚 1 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文食少，乳汁郁积。炒麦芽行气消食回乳，用于食积不消，妇女断乳。焦麦芽消食化滞，用于食积不消，脘腹胀痛。为中医临床上常用的一味中药。石楠藤为胡椒科胡椒属植物石楠藤Piper wallichii干燥带叶藤茎或全株。具有祛风通络，补肾壮阳，止咳平喘，活血止痛等功效。关于其化学成分及药理学的研究少见报道，在民间常用它来治疗劳伤，效果良好，湖北省五峰土家族民族自治地区民间广泛应用它来治疗腰腿疼痛等。本实验室已经对其化学成分进行了研究，从中得到了 8 个化合物，其中包括荜拨明宁碱及 3 种马兜铃内酰胺。有文献报道说明荜拨明宁碱具有较多功效，如有学者称提取于水果 P. chaba 的荜拨明宁碱能促进 3T3-L1 细胞脂肪形成，可用于降血脂8。马兜铃内酰胺（AL）是马兜铃酸（AA）在体内的主要代谢产物9，文献广泛报道含马兜铃酸AA的中药具有肾毒性，能导致肾小管间质肾病AAN，这已经引起了国内外学者广大的重视，其中马兜铃内酰胺 IAL-I与 AA-I 同样具有肾毒性，可以在一定浓度范围内导致直接的肾小管上皮损伤10-11。 2 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文第一章　中药麦芽提取物对高泌乳素血症小鼠泌乳素水平的影响第一节　麦芽总提取物对高泌乳素血症小鼠泌乳素水平的影响为了探讨单味中药麦芽对泌乳素分泌的影响，我们观察了麦芽总提取物对HPRL 雌性小鼠泌乳素水平的影响，并对提取物中黄酮及糖的含量进行了测定。一、　实验材料 1、动物雌性清洁级昆明种小鼠 60 只，体重 25±2 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 2、实验仪器 TD40 离心机长沙平凡仪器仪表有限公司；DFM-96 型放射免疫γ计数器；756-MC 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；MeltterAE-160 电子天平； 3、实验药物及试剂麦芽由湖北省十堰市中心医院提供，经华中科技大学同济药学院中药系张长弓副教授鉴定，麦芽提取物由本实验室制备，干燥至衡重；苯酚为重蒸酚，所需试剂均为分析纯；葡萄糖对照品（AR 级北京化学试剂二厂，105 ℃干燥至恒重）；芦丁对照品（批号 100080-200306）购于中国药品生物制品检定所；Parlodel 溴隐亭：Novartis Pharnas S.P.A；灭吐灵（甲氧氯普胺注射液），天津药业集团，批号 070911；PRL 放射免疫分析药盒由美国 DPC 公司提供。二、　实验方法 1、麦芽总提取物的制备 3 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文将 1 kg 干燥的麦芽药材适当粉碎，经 10 倍量水煎煮 2 次，每次 1.5 h，收集滤液，减压浓缩得麦芽提取物 314 g，产率为 31.4 。提取物放置 4 ℃冰箱下保存备用，用时加蒸馏水配制成所需浓度。 2、提取物中糖含量的测定 2.1 测定方法12 用苯酚-硫酸法测定不同浓度葡萄糖的吸光度来测定浓度-吸光度标准曲线，再将样品配成一定浓度的溶液测定其吸光度，代入浓度-吸光度标准曲线方程经计算所得糖含量。 2.2 对照品溶液的制备精密称取葡萄糖对照品 0.0207 g，置 100 mL 量瓶中，加双蒸水至刻度，摇匀，即得每 l mL 中含葡萄糖 0.2070 mg。 2.3 供试品溶液的制备精密称取提取物 0.0252 g，加双蒸水溶解，过滤，置 100 mL 量瓶中，加双蒸水至刻度，摇匀，即得。 2.4 标准曲线的绘制精密吸取一定量对照品溶液加水配制成 0，20，40，60，80，100 g/mL 一系列浓度，吸取上述各浓度标准溶液 2.0 mL，分别加入 5 苯酚溶液 1.0 mL，摇匀，迅速加入 5.0 mL 浓硫酸，混合均匀后，室温放置 30 min，用紫外分光光度法在波长 490 nm 处测定吸收度，空白对照以蒸馏水代替糖溶液，苯酚和硫酸加入量不变。以吸收度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线为 y19.452x0.003，R2 0.9996，结果表明，在 0.02～0.1 mg/mL 的浓度范围内具有良好的线性关系见表 1-1，图 1-1。表 1-1 标准曲线数据浓度（mg/mL） 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 吸光度（A） 0.378 0.790 1.188 1.567 1.930 4 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文２．５ｙ　＝　１９．４５２ｘ　＋　０．００３２２Ｒ　＝　０．９９９６１．５１０．５０００．０２０．０４０．０６０．０８０．１０．１２图 1-1 标准曲线图谱 2.5 方法学考察 2.5.1 精密度试验精密吸取同一供试品溶液 2.0 mL 置 25 mL 量瓶中，照标准曲线的绘制项下的方法，自“分别加入 5苯酚溶液”起依法测定吸收度，重复测定 6 次，记录吸光度，然后从标准曲线上读出供试品溶液中糖的含量，计算糖的平均含量 7.7，RSD 为 1.1 n6，实验结果见表 1-2。表 1-2 精密度试验次数 1 2 3 4 5 6吸光度（A） 0.764 0.739 0.753 0.756 0.747 0.748 RSD 1.1 2.5.2 重复性试验分别精密吸取 6 份供试品溶液 2.0 mL 置 25 mL 量瓶中，照标准曲线的绘制项下的方法，自“分别加入 5 苯酚溶液”起依法测定吸光度，然后从标准曲线上读出供试品溶液中糖的含量，计算糖平均含量 7.8 ，RSD 为 0.8 ，实验结果见表 1-3。表 1-3 重复性试验样品 1 2 3 4 5 6吸光度（A） 0.761 0.750 0.766 0.756 0.757 0.751 RSD 0.8 5 　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文 2.5.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液 2.0 mL 置 25 mL 量瓶中，照标准曲线的绘制下的方法，自“分别加入 5 苯酚溶液”起依法测定吸光度，分别在 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 记录吸收度，然后从标准曲线上读出供试品溶液中糖的含量，计算糖平均含量 7.7 ，RSD 为 0.5 ，说明供试品在 3 h 内稳定，实验结果见表 1-4。表 1-4 稳定性试验时间（h） 0.5 1 1.5 2 2.5 3 吸光度（A） 0.744 0.745 0.749 0.754 0.750 0.752 RSD 0.6 .

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